Смекни!
smekni.com

Литература - Другое (книга по генетике) (стр. 21 из 64)

ребром.

Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или

РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предвари-

тельной рестрикции и электрофореза носит название дот- или

слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на

фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На

рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих мето-

дов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с

электрофоретически разделенными молекулами РНК носит назва-

ние Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот - это

связывание электрофоретически разделенных белков, фиксиро-

ванных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих ме-

тодов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Сау-

зерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-

тальных подходов, используемых для анализа ДНК.

В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зонда-

ми не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.

Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на

фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромо-

сомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in

situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов исполь-

зуются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называ-

ется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый

ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и

подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафаз-

ных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена

на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение

имеет также подбор условий, максимально способствующих про-

цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК

и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании

радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обра-

ботки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК

зондов) места локализации последовательностей ДНК, компле-

ментарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно

наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответс-

твующими участками определенных хромосом (Рис.1.4).

Гибридизация in situ, является одним из наиболее эф-

фективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду

последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно

эффективна при исследовании распределения по геному повторя-

ющихся последовательностей ДНК, клонированных последователь-

ностей ДНК анонимного происхождения, при определении не

только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной

локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются

соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность

метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Сог-

ласно последним данным, в экспериментах на специально приго-

товленных и растянутых интерфазных хромосомах человека раз-

решающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что

составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного

бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов

ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успе-

хом решаются методом FISH.

Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми

зондами, проводимая на гистологических препаратах, является

одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифи-

ческого распределения и внутриклеточной локализации мРНК

(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными мето-

дом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их

многочисленными модификациями и вариантами можно ознако-

миться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,

1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.

ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК огра-

ниченного размера, используемая для поиска комплементарных

последовательностей в молекуле большего размера или среди

пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве

зондов используют искусственным образом синтезированные оли-

гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно

не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить вы-

деленные из генома последовательности ДНК. Однако значитель-

но чаще такие последовательности предварительно клонируют,

чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неог-

раниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание

(инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу

ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бакте-

риальные клетки хозяина (Рис 1.5). Химерные молекулы ДНК,

составленные из фрагментов разного происхождения, носят наз-

вание рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов

используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро-

и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-

трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от со-

тен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, глав-

ным образом, способностью вектора удерживать чужеродный

фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов

плазмидную ДНК.

Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные мо-

лекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе

копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с

изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-

залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие

клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря

чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз

и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются

плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заме-

тим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе

не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как

при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штам-

мы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды

имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую

поддержание их количества в клетке на определенном уровне -

от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.

Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным

контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клет-

ке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клони-

рующих векторов заключается во внесении изменений в систему

контроля репликации и в добавлении или вырезании генов анти-

биотикоустойчивости или удобных для клонирования иных гене-

тических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициа-

ции и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-

вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.

Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести

в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализа-

ции уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраива-

ние, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной

молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов

-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает коль-

цевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные

методы трансформации бактерий, то есть искусственного введе-

ния плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие

в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в ка-

честве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на

соответствующих селективных средах. При размножении

трансформированных бактерий происходит увеличение числа ко-

пий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чу-

жеродный для бактерий генетический материал может быть полу-

чен, практически, в любых количествах. Выделенная из бакте-

рий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-

ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в ка-

честве ДНК-зондов.

Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов

оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.

Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при

ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с

чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто техни-

чески эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,

размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью го-

ловки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают

последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна-

чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может су-

ществовать только в том случае, если в него встроена чуже-

родная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой

ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на

основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.

Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются

с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем

составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син-

тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда

gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликатив-

ных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК.

Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного

гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то

экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть поли-

пептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а

часть цепи будет транслироваться в соответствии с информаци-

ей, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок мо-

жет быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного

белка либо с помощью антител к специфическим участкам, коди-