активности генов в нормальных клетках, оценку клинического
выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-
ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-
лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма
экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.
Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-
зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-
чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По
весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-
ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках
печени - основной биохимической лаборатории организма - око-
ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,
1977). Это означает, что в различных соматических клетках
эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,
1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-
дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-
цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях
организма происходит избирательная активация многих других
специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает
значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-
рости их синтеза.
Контроль генной активности осуществляется за счет диф-
ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-
рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной
трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным
результатом которой является синтез функционально активного
белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной
активности, но и полноценность всех последующих этапов,
включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность
к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и
корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-
шающее значение для успешного анализа всего этого сложного
комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-
иск и целенаправленное конструирование которых представляет
вполне самостоятельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа
экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло-
нирования, генноинженерного манипулирования, направленного
введения сайт специфических мутаций, получения большого ко-
личества клонированных последовательностей ДНК, специфи-
ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно
используют генетически хорошо изученные прокариотические
системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов
трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут-
риклеточной локализации и функционирования чаще используют
культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль-
туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта-
пов развития патологического процесса, обусловленного
присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти-
ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи-
ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это
могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу-
ченные из специфических тканей больного человека, либо выде-
ленные из тканей линейных животных, служащих генетической
моделью наследственного заболевания.
Идентификация гомологичных генов у экспериментальных
животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют
исследование функциональной активности нормальных и мутант-
ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме-
ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле-
жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по-
лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци-
рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо-
дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен
чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе-
риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии
генов.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
и исследование мРНК, искусственные
транскрипционные системы.
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок
может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В
соответствии с этим исследования дифференциальной активности
генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы
контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех
этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и
изучение соответствующего белкового продукта, включая его
процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка-
неспецифическое распределение .
Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге-
нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю-
щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку-
лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов
проводят с использованием разнообразных современных методов
молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в
5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци-
фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы
путем исследования транскрипции в различных линиях клеток
при введении в них генов с искусственными делециями этих
участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу-
ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо
изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы-
ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в
составе векторных последовательностей вводят в культивируе-
мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня
экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло-
рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест-
венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.
Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя-
ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в
клетке, но и с высокой точностью проводить количественную
оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи-
мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек
африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди-
фицированы таким образом, что в них после трансфекции про-
исходит амплификация копий сконструированных определенным
образом эписом (внехромосомных генетических конструк-
ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг-
налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов
(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга-
низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных
манипуляций трансгенные животные могут быть также использо-
ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов
тканеспецифической активации генов in vivo.
Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для
изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных
модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%
из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-
руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При
этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов
среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от
0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения
индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-
чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на
тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ
РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических
срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов
используют клонированные последовательности кДНК и синтети-
ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на
цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой
несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-
вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-
бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-
тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не
только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-
лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,
Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей
пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-
цию среди них специфических молекул путем использования раз-
личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким
уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты
(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не
могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-
лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и
фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-
водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью
обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-
ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-
центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-
кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в
агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В
этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель
находится в логарифмической зависимости от длины последова-
тельности, что позволяет точно определить размер РНК
транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде
двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-
мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы