рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле-
ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые
линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и
6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот-
ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му-
таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х
типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в
первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу-
ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество
мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя
и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молеку-
лах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В
небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни
белка, ни мРНК.
В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген
HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые
могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибри-
дизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных
наследственных заболеваний, для которых была проведена моле-
кулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на
этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа
мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонук-
леазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп-
ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).
Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонук-
леазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время
в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, полови-
на которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и
в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют
структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки
отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нук-
леотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до-
мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение
составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около
15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как
и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперма-
тогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает
с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хро-
мосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984).
Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерози-
готных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается
вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержа-
щей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин -
облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест
не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фиб-
робластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано
предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся
в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной
мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона кле-
ток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT)
X-хромосомой (Marcus et al., 1992).
Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна
прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на про-
ведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,
SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим
секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика пре-
дусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по-
лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд
St14/TaqI).
Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансген-
ная животная модель наследственного заболевания человека,
сконструированная путем направленного переноса мутациий в
культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена
для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,
1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция
наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной
степени связаны с существованием селективных сред, позволяю-
щих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще,
синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не
только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения
многих теоретических вопросов биологии и медицины
(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).
Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в
необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT
(или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клет-
ки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические
программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день
отсутствуют (см.Главу IX).
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная
дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловлен-
ное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих
АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного
медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в
меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участ-
вующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3
формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме,
предположительно Германского происхождения, у гетерозигот
содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два
раза. При двух других, типичных формах - славянской и юве-
нильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в
пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравни-
тельно поздним началом и преимущественно неврологической
симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной
Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеноч-
ные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с позд-
ним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в
сыворотке крови больных.
Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в
2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирую-
щую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген
имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее иденти-
фицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни
Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et
al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также
обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван
АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нукле-
отидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что дока-
зывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).
Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфо-
узлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный
сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена
(6, 7, 8, 12 и 13).
Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мемб-
ранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт
фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сай-
та. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы
белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга
гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене
АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры,
а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее
время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том
числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 -
миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую
ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и
Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хро-
мосом, соответственно (Thomas et al., 1995).
В заключении данного раздела представляется целесооб-
разным кратко рассмотреть другие достаточно частые моноген-
ные заболевания, для которых показана и проводится молеку-
лярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме-
дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лабора-
тории молекулярной диагностики Институтата клинической гене-
тики РАМН (Москва).
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит
21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-ре-
цессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000
новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В за-
висимости от характера нарушения функции гена и, соот-
ветственно клинических проявлений "классическая форма" под-
разделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая фор-
ма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c из-
бытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).
В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического
комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных
21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и
псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзо-
не, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и
нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены
смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фак-
тор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину
3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая сте-
пень гомологии и тандемное расположение указвают на общность
эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить,
что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы
(называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитаю-
щих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только
ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого ско-
та функционально активны оба гена.
Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитох-
ром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в
11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон.
В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде
всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез
АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая