руемым чужеродной ДНК.
В последнее время большое распространение получило
клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе
преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе
плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,
отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы
могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фа-
говых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей
способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами
и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной
ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клониро-
вания в прокариотических системах.
Векторы, пригодные для направленного переноса в эука-
риотические клетки, конструируют на основе прокариотических
или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в
клетках эукариот, а также используют различные эукариоти-
ческие вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аде-
ноассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-
честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последова-
тельности, ответственные за начало репликации. Введение век-
торов в эукариотические клетки часто осуществляют путем
ко-трансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и
сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, вве-
денные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение
нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул -
эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК
в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последователь-
ности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и насле-
дуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).
Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-
держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихро-
мосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial
yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векто-
ров, содержащих в своем составе известные центромерные и те-
ломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые
для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Та-
кие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК
размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар осно-
ваний.
Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки
хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как
уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные
клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осущест-
вляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс
введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется
трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,
облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через
клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости
мембран используют два разных подхода. В первом случае про-
водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными
растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных
мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,
DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае
используют краткосрочное физическое воздействие на клетки
для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле-
кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным
электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и
т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес-
кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп-
росам молекулярного клонирования также посвящена обширная
литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани-
атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-
кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для
использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником
этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-
ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или
скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в
зависимости от специфических особенностей этих последова-
тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных
перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате
рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-
ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-
мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые
библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-
пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-
дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК
-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-
тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-
ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-
ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её
разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.
Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-
тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-
ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-
нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -
интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-
рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки
состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-
иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-
ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч
пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-
щихся последовательностей геномной ДНК человека получается
после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или
Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-
личество клонов с различными инсертированными фрагментами
ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-
мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в
одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные
библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -
10!6 различных клонов.
Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или
космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче
хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-
отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на
основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая
способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много
удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут
быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-
ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто
используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-
ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не
вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для
создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,
используется технология искусственных дрожжевых хромосом
-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)
фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-
нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-
ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных
ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или
космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на
фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека
сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают
на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-
зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-
зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие
чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры
и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят
их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-
ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-
тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-
тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на
рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-
зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК
последовательности, комплементарные зонду, или специфические
антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных
культурах производят именно в тех местах, где произошло по-
темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,
отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-
нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и
субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать
большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-
ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-
ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-
ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,
однако, определение нуклеотидной последовательности протя-
женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-
дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-
ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -
метод Сэнджера. В первом случае используют химическое
расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют