молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле
олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-
тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-
лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-
чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного
режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-
ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер
вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного
нуклеотида.
Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-
ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для
амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации
в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из
процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой
реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-
ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится
от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте-
зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР
обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого
специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.
Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и
выбирать оптимальные временные и температурные параметры для
каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы
возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень
проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме-
ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля-
ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают
небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст-
вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной
смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую
программу циклической смены температуры и длительности каж-
дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,
составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального
режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-
цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для
каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,
длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-
ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой
термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и
состав амплификационной смеси могут существенно варьировать
и зачастую подбираются эмпирически.
С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места
локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а
также изучать наличие любых других специфических особен-
ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на
основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици-
руемого участка. Разработаны различные варианты автомати-
ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото-
рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации
специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри-
дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со-
держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме-
чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли-
чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные
органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг-
леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не
препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве
источника матричной ДНК может быть использован любой, даже
деструктурированный биологический материал, сохранивший в
своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных
молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен-
ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна
крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины
хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль-
туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не
прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге-
нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-
ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-
еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более
подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде
специальных руководств и инструкций.
Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь-
зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции
или от характера последующего молекулярного анализа амплифи-
катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа-
щих различные повторяющиеся последовательности или необычные
структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич-
ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в
два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором
этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,
продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих
случаях для повышения специфичности праймирования используют
систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,
то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают
последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в
первом раунде участка ДНК.
В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,
то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-
ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в
реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас-
луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.
На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии
генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,
что реакцию амплификации можно проводить не только в раство-
рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при
этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты
амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар-
ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase
reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи-
кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В
последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо-
вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра-
зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ-
ального температурного режима полимеразных циклов), возможно
проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В
частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со
вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et
al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ-
но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,
так как этот метод по праву стал один из основных в молеку-
лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;
Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).
Возможность очень точного и специфичного выбора участ-
ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо-
лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-
лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную
ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле-
те в виде красной полосы после электрофоретического концент-
рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.
Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот
гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.
При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках
ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли-
чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в
соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем
электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в
размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет
делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат-
ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых
молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также
структурные изменения в дуплексах между нормальными и му-
тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на-
конец, возможно определение полной нуклеотидной последова-
тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му-
таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму-
щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-
чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более
подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью
ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ
определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом
отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу-
тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.
Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и
клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова-
ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству-
ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо-
ванием ПЦР.
ГЛАВА VI.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото-
рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда-
ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге-
нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на
этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные
этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо-
вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции