GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо-
дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким образом, существуют относительно небольшие
участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше,
чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in
vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК
метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити-
дина. Экспериментальное изучение характера метилирования
основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую-
щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты
узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но
действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того,
находится ли это основание в метилированном состоянии или
нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после-
довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля-
ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили-
рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к
повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в
местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' -
сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается
характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3'
последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные
индивидуумы, независимо от их этнического происхождения,
практически не различаются по характеру метилирования ДНК в
одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене-
тической дифференцировки происходят значительные изменения
рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу-
холевого происхождения число метилированных сайтов резко
уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между
метилированием ДНК и состоянием генетической активности в
клетках. Существует класс белков, которые специфическим об-
разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их
недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз-
можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен-
тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации
эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив-
ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области
генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде-
тельствует о функциональной активности генов. Показано, что
необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-
ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-
лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-
мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а
также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-
номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности
некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть
прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-
ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-
рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-
ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,
родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных
факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов
узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих
неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-
ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-
пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-
ляются характерной особенностью транскрибируемых участков
генома. Их идентификация в клонированных последовательностях
геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных
структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG
островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-
ные методы регистрации СрG островков показали, что их число
в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека
сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-
но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-
ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-
димому, это необходимое, но не достаточное условие их
экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-
няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-
торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-
ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-
тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-
ях это области функционально активных генов, находящихся в
деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-
тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод
ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-
мосомных препаратах визуализировать функционально активные
районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-
тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-
мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-
ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно
только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-
тивные гены (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА YIII.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1. Генетические линии животных.
Большая роль в исследовании проблем генетики челове-
ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим
линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей
(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент
сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую-
щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных
генов млекопитающих и человека, а также наличие большого
числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе-
нием генов наряду с возможностями использования очень мощных
экспериментальных подходов для идентификации и клонирования
генов линейных животных позволяют проводить параллельные
исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и
молекулярного анализа индивидуальных генов человека.
Для многих моногенных заболеваний человека животные,
несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а
зачастую и единственными моделями для исследования молеку-
лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече-
ния, в том числе и с применением методов генной терапии
(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде
всего, ведется, среди уже существующих генетических линий
животных с установленным типом наследования определенных
аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до-
казательство идентичности мутантных генов и, соответственно
первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных
животных.
В различных питомниках мира, в том числе и в России,
созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков
до несколько сотен генетических линий различных эксперимен-
тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню-
хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и
др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно-
гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,
удобства содержания, относительной легкости эксперименталь-
ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые
из этих линий представляют собой случайные находки, другие,
а их большинство, получены в результате действия различных
мутагенных факторов. Так, значительное число биологических
моделей было получено путем биохимической селекции потомства
мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-
мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так
были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,
почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу-
чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск
спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу-
чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного
гена.
Процесс создания подобных генетических линий обычно
включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ
наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ-
кородственное разведение отселектированных особей. При моно-
генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять
из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози-
готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше-
ния плодовитости у гомозигот.
На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо
моногенного наследственного заболевания руководствуются
сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом
мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста-
точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность
генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока-
зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из-
менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная
мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько
сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу-