Смекни!
smekni.com

Литература - Другое (книга по генетике) (стр. 46 из 64)

кДНК

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод

анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-

ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на

регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-

нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся

вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-

ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших

однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной

последовательности, так что замена даже одного основания в

молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-

ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-

ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,

обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-

зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-

рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-

дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения

ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме

используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT

Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с

этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-

ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные

внешние факторы - температура, концентрация акриламида и

глицерина в геле, ионная сила буферных растворов

(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-

воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,

различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный

метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое

распространение благодаря своей простоте и возможности обна-

руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций

при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о.

составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400

п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-

тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан

на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших

двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь-

ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых

фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ-

ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению

со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-

намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-

ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при

их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-

диент денатурации достигается разницей температур, различной

концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих

условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,

отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру-

ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю-

щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле-

отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При

электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в

геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату-

рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго

специфичной для данной последовательности области, эквива-

лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу-

ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью

может соединиться или разойтись. После начала плавления

продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля-

ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле-

кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не

наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит

разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному

составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около

50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до

нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при

прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату-

рация концов молекул еще до достижения оптимальной области

плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам-

плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на

процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив-

ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру-

ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет

присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте-

тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько

десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы

выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают

шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от

их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди-

фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В

отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро-

ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600

п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает

95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута-

ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы

используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом

применен также для анализа индуцированных мутаций, так как

позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од-

ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме-

тода следует отнести техническую сложность получения равно-

мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном

геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных

GC-концов.

HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз-

воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или

в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля-

ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы-

ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных

хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо-

логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но

их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.

Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых

в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких

мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута-

ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в

том, что при амплификации относительно небольших фрагментов

генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может

быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич-

ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти-

пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль-

ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле-

кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав-

нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под-

вижности) за счет конформационных особенностей в местах

несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия

могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри-

ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо-

и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании

новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность

идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах

ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу-

ществляется как изотопным, так и неизотопными методами

(Grompe, 1993).

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического

расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности

некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК

в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так,

цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к

действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода

используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.

Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву

молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций

осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих,

как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.

Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды,

клонированные последовательности ДНК или амплифицированные

фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).

При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме-

шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми

образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные

соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные

фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых

молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо-

вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах

ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации

между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК,

образуются места негомологичного спаривания. После обработки

соответствующими химическими агентами идентификация и лока-

лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово-

дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко-

роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео-

бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии

мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен-

тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной

тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода

CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций

(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:

(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2

кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать

несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность