9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных
систем.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных заболе-
ваний.
Раздел 9.6 Генотерапия ненаследственных заболеваний:
опухоли, инфекции.
Раздел 9.7 Некоторые этические и социальные проблемы ген-
ной терапии.
ГЛАВА X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 10.1 Хромосомная локализация и принципы класси-
фикации генов наследственных болезней.
Раздел 10.2 Метаболические дефекты лизосомных фермен-
тов. Болезни накопления.
Раздел 10.3 Болезни экспансии, вызванные "динамически-
ми" мутациями.
Раздел 10.4 Моногенные наследственные болезни, диаг-
ностируемые молекулярными методами в России.
10.4.1 Муковисцидоз.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
10.4.3 Гемофилия А.
10.4.4 Гемофилия B.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
10.4.6 Фенилкетонурия.
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА Y.
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО
МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
Молекулярная идентификация мутантных аллелей и разра-
ботка эффективных методов их диагностики у больных и у гете-
розиготных носителей являются той экспериментальной базой,
которая позволяет исследовать распространенность мутаций в
различных этнических группах и популяциях. Одновременно воз-
можен анализ сцепления мутантных аллелей с другими генети-
ческими маркерами и оценка на этой основе предполагаемых ме-
ханизмов возникновения и поддержания в популяциях наблюдае-
мого уровня изменчивости. Но прежде чем перейти к описанию
основных целей и методов популяционного анализа мутаций оп-
ределим более точно два основных понятия, часто используемых
при проведении подобных исследованиях - это понятия полимор-
физма и неравновесности по сцеплению.
Генетическая изменчивость локуса в определенной попу-
ляции измеряется уровнем полиморфизма, и количественным вы-
ражением этой меры служат частоты аллелей. В однолокусной
двухаллельной системе частоты двух вариантов аллелей - А1 и
А2, обозначаются буквами p и q, соответвственно, и (p+q=1).
Когда мы говорим, что в популяции существует полиморфизм по
мутации, это значит, что ее частота выше определенного выб-
ранного в соответствии с какими-то причинами условного уров-
ня, чаще всего выше 5%. Высокополиморфными считаются локусы
с близкими значениями частот аллелей. В больших популяциях
со случайным характером скрещивания, то есть в панмикти-
ческих популяциях, действует закон Харди-Вайнберга, согласно
которому частоты гомозиготных особей в популяции равны p!2 и
q!2, соответстенно, а доля гетерозигот равна 2pq. Таким об-
разом, в двухаллельной модели частота гетерозигот в популя-
ции по полиморфным локусам составляет от 10% и более, а по
высокополиморфным локусам может достигать 50%. Если число
аллелей в локусе больше двух, общая частота гетерозигот в
популяции равна 1 - (p1!2 + p2!2 + ... + pn!2), где pk -
частота аллеля Ak, k = 1, 2, ... n и p1 + p2 +... + pn = 1.
При этом доля гетерозигот в популяции возрастает с увеличе-
нием числа аллелей и достигает максимального предела в каж-
дой группе из n аллелей при равенстве их частот. Таким обра-
зом, при увеличении числа аллелей, встречающихся с равными
вероятностями, частота гетерозигот в популяции будет стре-
миться к единице, то есть подовляющее число особей в популя-
ции будут гетерозиготными по данному локусу. Такая ситуация
характерна для высокополиморфных микросателитных повторов, в
частности STR, что и делает их наряду с другими преимущест-
вами наиболее удобными генетическими маркерами.
Как мы уже упоминали, частыми моногенными наследствен-
ными заболеваниями считаются такие, при которых один больной
ребенок встречается среди 2000 - 10000 новорожденных, то
есть q!2 колеблется в пределах 1 /2000 - 1/10000. Соот-
ветственно, частота мутаций - q, в этих генах составляет от
0.5% до 2.5% и доля гетерозиготных носителей - 2pq, достига-
ет 1% - 5%. Для более редких заболеваний частоты гетерозигот
не превышают десятых долей процента. Тем ни менее, если
учесть, что общее количество различных моногенных заболева-
ний составляет около 5000 нозологий, оказывается, что, в
среднем, каждый человек является носителем мутантных аллелей
около десяти генов. В общем случае, набор этих генов разли-
чен у разных людей, и только в тех семьях, где оба родителя
являются носителями мутаций одного и того же гена появляется
25%-ый риск рождения больного ребенка.
До сих пор мы рассматривали изменчивость в одном локусе
- A. Понятие неравновесности по сцеплению определяет отноше-
ния между изменчивостью в двух локусах - A и B. Ситуация
здесь может быть двоякой. Если изменчивость в этих локусах
независима, то аллели двух локусов встречаются в популяции в
случайных комбинациях. Однако, если аллели различных локусов
в одних комбинациях встречаются чаще, чем в других, то гово-
рят, что существует неравновесность по сцеплению. Количест-
венно эта связь оценивается с помощью детерминанта неравно-
весности по сцеплению - d. Рассмотрим, чему равен детерми-
нант неравновесности по сцеплению в двухлокусной двухаллель-
ной системе. Пусть Pnm, где n=1,2 и m=1,2, частоты четырех
возможных в этом случае типов гамет - A1B1, A2B2, A1B2,
A2B1, а Pn и Rm - частоты аллелей локусов A и B, соот-
ветственно. Если сочетания аллелей в гаметах случайны, то
теоретически ожидаемые частоты гамет четырех типов равны
произведению частот входящих в эти гаметы аллелей, то есть
Pnm=Pn*Rm. В этом случае произведение частот двух типов га-
мет (A1B1 и A2B2), находящихся в состоянии "притяжения",
равно произведению частот гамет в состоянии "отталкивания"
(A1B2 и A2B1), то есть P11*P22 = P1*P2 *R1*R2 = P12*P21. Од-
нако, если сочетания аллелей в гаметах неслучайны, то эти
произведения различны. Их разность служит мерой неравно-
весности по сцеплению - d. Итак d = ¦P11*P22 - P12*P21¦ При
отсутствии неравновесности по сцеплению d = 0. Верхняя гра-
ница d = 0.25. Максимальная неравновесность по сцеплению
достигается при полном отсутствии двух типов гамет, находя-
щихся либо в состоянии "притяжения", либо в состоянии "от-
талкивания", при одновременном равенстве частот оставшихся
двух типов гамет.
Мутации в различных локусах возникают, как правило, не-
зависимо друг от друга и наличие неравновесности по сцепле-
нию, по-видимому, отражает тот факт, что мутация в одном из
локусов возникла в хромосоме, несущей определенный аллель
другого локуса, и далее эта хромосома получила распростране-
ние в популяции. Неравновесность по сцеплению является очень
важной популяционной характеристикой, позволяющей судить о
порядке и примерном времени возникновения различных мутаций,
а также оценивать возможные механизмы их поддержания в попу-
ляции. Обнаружение сильной неравновесности по сцеплению меж-
ду специфическими мутациями гена и определенными аллелями
маркерных локусов имеет важное практическое значение. Часто
наблюдается неравновесность по сцеплению между мутантными
аллелями гена и одновременно несколькими маркерными локуса-
ми. В этом случае анализ маркерных гаплотипов, то есть набо-
ров аллелей различных локусов, локализованных в одной хро-
мосоме, дает возможность с высокой степенью вероятности оце-
нивать характер мутационного повреждения и прослеживать его
наследование в семьях больного.
Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
Считается, что средняя частота спонтанного возникнове-
ния мутаций в структурных локусах человека колеблется в пре-
делах от 10(-5) до 10(-6) на одну гамету за каждое поколе-
ние. Однако, эта величина может значительно варьировать для
разных генов, меняясь в пределах от 10(-4) для высокомута-
бильных локусов до 10 (-11) в наиболее устойчивых частях ге-
нома. Эти различия зависят от многих факторов и, в первую
очередь, от характера мутационного повреждения, от механизма
возникновения мутации и локализации нарушения. Большое зна-
чение также имеет сам ген, протяженность его кодирующих об-
ластей и те функции, которые выполняют контролируемые им мо-
лекулы в обеспечении жизнедеятельности клеток и всего орга-
низиа, в целом. Так например, нарушение работы генов, про-
дукция которых необходима на ранних стадиях эмбриогенеза,
может приводить к гибели плода. Такие мутации трудны для ди-
агностики и в практической медицине мы чаще всего имеем дело
только с теми мутациями, которые не проявляют летального эф-
фекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Тем ни ме-
нее, не исключено, что ранние эмбриональные летали составля-
ет немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и
вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции.
Особого внимания заслуживает проблема мутирования в
STR-сайтах и в VNTR- локусах, часто используемых в настоящее
время для геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики.
Эти участки генома, изменчивость в которых обусловлена раз-
личиями в числе тандемных повторов, формально можно отнести
к разряду высокомутабильных. Заметим сразу, однако, что пря-
мое сопоставление темпов мутирования в кодирующих областях
генома и в мини- и микросателлитных последовательностях ДНК,
по-видимому, некорректно, так как физическая основа изменчи-
вости, наблюдаемой в этих функционально и структурно разли-