скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-
чения направления поля. При этом более короткие молекулы
легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в
геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего
гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-
ческим расположением направлений полей - ортогональный,
гексогональный, инверсионный. При использовании любого из
этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от
50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-
ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от
условий проведения электрофореза (напряжение, температура
буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-
честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК
используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной
массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих
специфические последовательности, также может быть осущест-
влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и
идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из
геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-
роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с
целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В
последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-
ментов ДНК широко используется метод клонирования в
искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения
библиотек генов на основе YAC-векторов.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
по хромосоме, идентификация и изоляция генов.
Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют
около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.
4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов
и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар
нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых
с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-
ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых
минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-
довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-
вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-
ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-
тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-
ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно
содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят
упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-
ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-
ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-
фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее
мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых
можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-
ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-
ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это
насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-
фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-
вания различными методами инсертированных в них фрагментов
ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-
ванными в заданном районе. Значительно чаще используется
тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,
сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-
варительно отобранных на основании сцепления с различными
ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных
сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск
в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые
последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими
методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по
хромосоме.
"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование
(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-
держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-
ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе
проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-
ленной с геном. После нахождения положительных клонов
последние сами служат зондами для изоляции других клонов,
содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об-
разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест-
ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре-
зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол-
ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных
клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-
тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно
установить степень перекрывания между соседними фрагментами
и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".
При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого
нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-
ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо-
бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном
направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно
клонируемых последовательностей ДНК.
Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса
поиска генных последовательностей американским исследовате-
лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че-
ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот
метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено-
ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),
не изолируя при этом все промежуточные последовательности
ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной
схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то
есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с
геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива-
ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются
большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж-
ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за
счет искусственного присоединения к их концам небольшого
маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов
сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими
рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов
ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следова-
тельно, и окружающие его концевые участки исходных крупных
фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаго-
вых или космидных векторах, получая библиотеку генов конце-
вых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг кло-
нов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах компле-
ментарные зонду последовательности соединены маркерным геном
с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка
поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег-
менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме-
тода скользящего зондирования.
Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно
отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых
других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;
Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,
1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три
группы. В первой группе исследуют структурные особенности
генных последовательностей. Вторая группа критериев основана
на поиске функциональных участков генов. В третьем случае
анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести-
руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге-
нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым
скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг-
ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),
промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,
а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в
них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов
может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных
фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео-
тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую-
щими в базах данных идентифицированными генами других видов
живых существ.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,
представленные в геноме уникальными последовательностями,
достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует
высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми
генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,
так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова-
тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную
гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи-
вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,
птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова-
тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в
инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру-
ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге-
нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на-
личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).
Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть
осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей
нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони-
рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова-
ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).
Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК
гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в
тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой