больного с большой вероятностью могут быть гетерозиготными
носителями мутантных аллелей, поэтому в тех случаях, когда
это возможно, они подлежат обследованию в первую очередь.
Для болезней, сцепленных с полом, это родственники по женс-
кой линии - сестры, дочери и тетки пробанда. Их диагностика
особенно важна, так как вероятность рождения больных сыновей
в потомстве носительниц мутаций очень высока и не зависит от
генотипа супруга. При аутосомно-рецессивных заболеваниях по-
ловина сибсов родителей и 2/3 здоровых сибсов больного будут
гетерозиготными носителями мутации. Поэтому в тех семьях,
где принципиально возможна молекулярная идентификация му-
тантных аллелей, необходимо обследовать максимальное число
родственников больного пробанда для выявления гетерозиготных
носителей. Иногда в больших семьях с разветвленными родос-
ловными удается проследить наследование неидентифицируемых
мутаций с помощью косвенных методов молекулярной диагности-
ки.
Для заболеваний, распространенных в определенных попу-
ляциях или в каких-то этнических группах и обусловленных
присутствием одного или нескольких преобладающих и легко
идентифицируемых мутантных аллелей, возможно проведение то-
тального скрининга на гетерозиготное носительство этих мута-
ций среди определенных групп населения, например, среди бе-
ременных женщин или среди новорожденных. Считается, что по-
добный скрининг экономически оправдан в том случае, если при
проведении процедуры выявляются аллели, составляющие не ме-
нее 90 - 95 % всех мутаций данного гена в исследуемой попу-
ляции. Выявленные при подобных обследованиях носители мута-
ций также составляют группу риска, и в последующем должны
быть аналогичным образом протестированы их супруги. Однако,
даже в том случае, если мутация найдена только у одного из
родителей, вероятность рождения больного ребенка несколько
выше популяционной частоты, но, конечно, значительно меньше
25%. Конкретное значение этого риска зависит от общей часто-
ты мутаций соответствующего гена в популяции. В таких семьях
по желанию родителей также может быть проведена пренатальная
диагностика и прослежено наследование мутантного аллеля. При
отсутствии этой мутации у плода прогноз считается благопри-
ятным, независимо от того, какие аллели ребенок получит от
второго супруга.
Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
в пренатальной диагностике моногенных болез-
ней.
Следующим шагом после отбора нуждающейся в пренатальной
диагностике семьи является комплексное молекулярное обследо-
вание ее членов - родителей и, если есть такая возможность,
больного ребенка. Эти исследования могут быть достаточно
длительными и поэтому желательно их проводить до наступления
беременности. Результаты молекулярного обследования семьи
служат основой для назначения и выбора способов проведения
пренатальной диагностики. После этого семья планирует бере-
менность, и в определенные сроки женщина поступает в клинику
для проводения процедуры, обеспечивающей забор необходимых
для диагностики тканей плодного происхождения. При этом сле-
дует учитывать, что определение конкретных сроков этой про-
цедуры зависит от многих медицинских показаний (в превую
очередь, акушерских), обеспечивающих максимальную безопас-
ность подобного инвазивного вмешательства как для матери,
так и для будущего ребенка (Баранов и др.,1994; Бара-
нов,1994).
Наиболее объективная информация о наличии моногенного
наследственного заболевания у плода может быть получена при
анализе его ДНК и обнаружении мутационных изменений в коди-
рующих или регуляторных последовательностях соответствующих
генов. Практическая диагностика мутантных аллелей в семьях
высокого риска проводится для заболеваний с известным спект-
ром наиболее часто встречающихся мутаций. При этом для каж-
дой болезни разрабатываются относительно простые и наиболее
эффективные методы идентификации мутантных аллелей. В насто-
ящее время насчитывается уже несколько сотен таких заболева-
ний и количество их быстро увеличивается (Baranov,1993; Ба-
ранов,1994; см.Главу X).
Для генотипирования мутаций, то есть для выяснения при-
роды мутантных аллелей у больного и его родителей использу-
ются различные стандартные методы, подробно изложенные в
главе IV. Выбор конкретного метода зависит от типа предпола-
гаемых мутаций и от методических возможностей диагностичес-
ких центров. При отсутствии у пробанда наиболее частых и ра-
нее описанных мутаций его ДНК может быть направлена в специ-
ализированные молекулярно- генетические лаборатории для бо-
лее тщательного анализа с использованием всего комплекса ме-
тодов идентификации мутаций вплоть до получения и секвениро-
вания мутантных кДНК- вых последовательностей гена. Однако,
подобные исследования очень дороги, требуют много труда и
времени и потому в обычной клинической практике используются
достаточно редко. В этих случаях чаще прибегают к косвенным
методам молекулярной диагностики (см. раздел 7.1). Для мно-
гих заболеваний, эти методы все еще остаются единственно
возможными (см.Главу X). Однако, как уже указывалось, они
требуют обязательного обследования полной семьи, включая
больного ребенка. При его отсутствии молекулярное маркирова-
ние мутантных генов у гетерозиготных родителей становится
невозможным, а, следовательно, невозможна и пренатальная ди-
агностика.
Идентификацию мутантных генов осуществляют путем срав-
нения маркерных генотипов родителей и больного ребенка. Если
не произошел кроссинговер между маркерным локусом и геном,
все больные дети в семье должны иметь одинаковый маркерный
генотип. Поэтому при проведении пренатальной диагностики
сходство генотипов плода и пробанда является необходимым,
однако в ряде случаев, вовсе не достаточным условием для
подтверждения наличия заболевания. Так, например, у гомози-
готных по маркеру родителей все дети будут иметь одинаковый
генотип по этому локусу независимо от присутствия мутантных
аллелей гена. Необходимым условием дифференцировки нормаль-
ных и мутантных генов у носителей мутаций является их сцеп-
ление с разными аллелями маркерного локуса. Поэтому, дискри-
минация мутантных генов у родителей возможна только с по-
мощью гетерозиготных маркеров. При этих условиях мутантные
гены родителей могут быть определены по тем маркерным алле-
лям, которые присутствуют у больного ребенка. Однако, иден-
тификация по маркерным аллелям обоих мутантных генов возмож-
на лишь в тех случаях, когда родители гетерозиготны, а про-
банд (больной) гомозиготен по маркерному локусу.
Возможность идентификации мутантных генов родителей на
основе анализа маркерных генотипов определяет информатив-
ность семьи по отношению к данному маркеру. На Рис.7.1
представлены возможные маркерные генотипы в полностью и час-
тично информативных, а также в неинформативных семьях при
определении их путем блот-гибридизации с ДНК-зондом. Анало-
гичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда
маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих по-
лиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В инфор-
мативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличает-
ся от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса,
поэтому можно проследить наследование мутантных генов при
каждой беременности. В этом случае сходство маркерных гено-
типов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прог-
ноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип. В
частично информативных семьях идентифицируется только один
из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ре-
бенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей.
В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и про-
банда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%.
Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но по-
ловина из них будет нести один из мутантных аллелей. Неин-
формативный маркер не пригоден для идентификации мутантных
генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диаг-
ностики в данной семье. При отсутствии полной информативнос-
ти необходимо исследовать другие сцепленные с геном поли-
морфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, ко-
торые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состо-
янии. В частично информативных семьях можно проводить прена-
тальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и
в полностью информативных семьях, при одновременном исполь-
зованием двух полиморфных локусов, каждый из которых марки-
рует разные мутантные гены обоих родителей. Информативными
оказываются также те семьи, в которых один из мутантных ал-
лелей может быть идентифицирован прямым анализом соответс-
твующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля
доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моно-
генных наследственных заболеваний количество идентифициро-
ванных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контро-
лирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей
высокого риска оказались полностью информативными, а значит,
пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с
использоваанием молекулярных методов тестирования состояния
плода.
Таким образом, при отсутствии возможности прямой иден-