тификации соответствующих мутантных аллелей, анализ информа-
тивности семьи следует начинать с наиболее полиморфных мар-
керных локусов. так как при этом больше вероятность того,
что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по
выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно
также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеп-
лению, так как чаще всего информативность семей в отношении
маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению,
будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и
транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению ло-
кусах обуславливает повышенную вероятность таких событий,
при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются го-
мозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отно-
шении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности
семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы,
находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.
Следует также учитывать, что определенные аллели поли-
морфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей
однократно много лет назад и распросранившейся в популяции,
будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению.
Примером может служить неравновесность между delF508 (ориен-
тировочный возраст возникновения 30-50 000 лет) и 6-ти член-
ным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза
(Chebab et al., 1993; Агбанглы и др., 1994). Поэтому в семь-
ях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное
значение которой определяется детерминантом неравновесности
по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю, окажут-
ся также гомозиготами и по мутации, то есть будут больны.
Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только
на этой информации, однако, её следует учитывать при выра-
ботке комплексного заключения относительно здоровья будущего
ребенка.
Во всех случаях при использовании косвенных методов мо-
лекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркер-
ный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точ-
ностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем
и маркерным локусом. Поэтому, чем ближе расположен маркер по
отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки
при проведении пренатальной диагностики. Для того чтобы пол-
ностью избежать или, по крайне мере, резко снизить вероят-
ность такой ошибки, желательно использовать внутригенные
маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с
помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный ал-
лель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень
протяженными генами ( например геном дистрофина длиной около
2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного
кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
нозирования.
Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному
тестированию, практически, не зависит от формы нозологии,
так как для анализа генов и мутантных аллелей используется
один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного
или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож-
дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение
пренатальной диагностики становится возможным на любой ста-
дии развития и при любом сроке беременности.
ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека,
безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп-
ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и
трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде-
лить ее в самостоятельное научно-практическое направление -
доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней
(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в
этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до-
имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп-
ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X
-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все
еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ-
кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях
развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек-
леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом
микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является
сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери-
рованных зародышей после их искусственной трансплантации в
матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её
современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в
уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть
определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом
числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос-
сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае-
мой по числу наступивших беременностей и родов, методы доим-
плантационной диагностики наследственных болезней будут
привлкать к себе все большое число исследователей. Однако,
практическая значимость такого подхода в виду его высокой
стоимости и недостаточной надежности еще сравнительно долго
будет оставаться проблематичной, по крайней мере, в нашей
стране.
Обобщенный опыт различных молекулярных диагностических
центров мира свидетельствует о том, что оптимальным для пре-
натальной диагностики является первый триместр беременности
(10-12- недели), поскольку при неблагоприятном прогнозе бе-
ременность может быть прервана обычным медицинским абортом.
Зачастую молекулярную диагностику проводят и во втором три-
местре беременности (обычно на 17-21 неделях). Необходимые
для анализа образцы ДНК плода выделяют из биоптатов хориона
(плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или
из лимфоцитов пуповинной крови при помощи соответствующих
инвазивных процедур - хорионбиопсия, плацентобиопсия, амнио-
центез или кордоцентез, которые проводятся под контролем уль
тразвука (Рис. 7.3). Подробнее об этих методах, их преиму-
ществах и недостатках можно узнать в соответствующих моног-
рафиях и обзорах (Рарр,1992; Баранов, 1994; Баранов и др.,
1994). Диагностика во 2-м триместре беременности нередко по-
казана для неинформативных семей в случае тех нозологий,
пренатальная диагностика которых принципиальна возможна пу-
тем биохимического тестирования первичных нарушений (напри-
мер муковисцидоз) или оценки каких-либо иных проявлений бо-
лезни у плода.
Основным источником ДНК для диагностики в постнатальном
периоде являются лимфоциты крови. Реже для этих целей ис-
пользуют другие ткани и биологические жидкости, содержащие
клеточные элементы (слюна, кости, моча). Если семья частично
информативна (идентифицируется либо доступен молекулярной
маркировке лишь один мутантный аллель), также рекомендуется
диагностика в 1-м триместре беременности, так как она позво-
ляет отвергнуть диагноз у 50% всех плодов при аутосомно-ре-
цессивных заболеваниях, что доказывается отсутствием иденти-
фицируемого мутантного аллеля. В противном случае дальнейшая
тактика определяется исходя из пожеланий женщины и возмож-
ностей для уточнения диагноза на более поздних сроках разви-
тия (II-й триместр беременности). Так, в случае пренатальной
диагностики муковисцидоза результаты молекулярных исследова-
ний могут быть дополнены биохимическим тестированием фермен-
тов амниотической жидкости на 18- 20-й неделях беременности
(Горбунова и др., 1991; Baranov et al., 1992); в случае ге-
мофилии А - прямым серологическим исследованием активности
фактора Y11 свертывания крови (Aseev et al., 1994); в случае
миодистрофии Дюшенна - иммуноцитохимическим анализом дистро-
фина в биоптатах мышц плода (Hoffman et al., 1992) и т.д.
Следует однако подчеркнуть, что современный уровень молеку-
лярных знаний о природе гена, его мутациях и полиморфизмах
позволяет в идеале проводить молекулярную диагностику наибо-
лее частых моногенных заболеваний, практически, во всех слу-
чаях. Возможности молекулярной диагностики в России пока
весьма ограничены ( Baranov, 1993 ;см. Глава X). Кроме того,
ситуация осложняется сравнительно поздним (часто, уже во
время беременности) обращением семей высокого риска на пре-
натальную диагностику, что не позволяет провести молекуляр-
ные исследования ее информативности в полном обьеме. Связано
это, в первую очередь, с плохой информированностью населения
о работе соответствующих медико-генетических служб.
Из всех существующих способов пренатальной диагностики
методы, основанные на анализе ДНК, являются наиболее точны-
ми, так как они выявляют первичные нарушения в структуре ге-
нов. Это прежде всего относится к тем заболеваниям, диагнос-
тика которых осуществляется путем прямой идентификации му-
тантных аллелей. Тем ни менее, даже в этом случае оконча-
тельное заключение о здоровье будущего ребенка хотя и приб-
лижается к абсолютному, но все же носит вероятностный харак-
тер. Основным источником ошибок при проведении пренатальной
диагностики служит возможная контаминация материала плода,
используемого для постановки диагноза, другими тканями, в
первую очередь, материнского происхождения. Поэтому сразу
после взятия диагностического материала путем биопсии хорио-
на, амниоцентеза или кордоцентеза проводят тщательную его
оценку с использованием разнообразных лабораторных методов.
Отличие молекулярных методов тестирования от биохимических
или любых других заключается в их повышенной чувствительнос-