целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум
критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих
тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио-
теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным
первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из
пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь-
ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою
очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления
всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К
сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза-
ция может не дать положительных результатов.
Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите-
риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,
являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность
выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован-
ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные
доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК
специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе-
ны, например, при определении нуклеотидной последователь-
ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова-
тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа-
тельством в пользу правильности проведенной идентификации
гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в
изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих
соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,
при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони-
руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная
мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша-
ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв-
ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция
первичного биохимического дефекта, выполненная на соот-
ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой-
кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био-
логических моделей данного наследственного заболевания.
Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге-
номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта
оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз-
мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию
гена, так как позволяет определить его границы в геномной
ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре-
гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова-
тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино-
кислотную последовательность соответствующего белка и таким
образом определить первичное биохимическое звено в патогене-
зе соответствующего наследственного заболевания.
Описанный способ изучения молекулярных и биохимических
основ наследственных заболеваний получил название обратной
генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от
белка к гену, так называемого функционального клонирования,
был назван позиционным клонированием, тем более, что термин
обратной генетики уже использовался ранее для обозначения
метода анализа функции гена путем направленного введения в
него мутаций (Collins, 1992).
Возможность использования функционального клонирования
зависит от доступности информации о белковом продукте и/или
о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль-
шинства моногенных болезней определение первичного биохими-
ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу
из-за недостаточного понимания функционирования огромного
числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,
низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе-
ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о
клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи-
мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных
о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности
генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их
сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно-
го клонирования в идентификации генов, ответственных за
наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе-
зусловного доминирования последнего.
Успех позиционного клонирования определяется возмож-
ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется
уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8
представлена общая схема позиционного клонирования, за-
имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для
нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления
используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения
хромосомной принадлежности картируемого гена более
точная локализациия может быть установлена с помощью при-
цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде-
ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп-
ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель-
но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически
видимой структурной перестройки в области локализации этого
гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци-
енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно-
го такого случая может исключить необходимость картирования
гена путем последовательного анализа его сцепления с генети-
ческими маркерами целого генома и позволит перейти не-
посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об-
разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,
миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-
рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных
болезней.
С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли-
тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод
"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож-
дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов
и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование
методами гибридизации in situ большого количества анонимных
кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи-
ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель-
ному увеличению степени насыщенности различных сегментов
хромосом известными генными последовательностями, среди ко-
торых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в
этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим
линиям животных, моделирующим различные наследственные забо-
левания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нук-
леотидных последовательностей кодирующих участков гомологич-
ных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа
консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов
позволяют успешно вести параллельные исследования геномов
человека и других животных, значительно ускоряющие эффектив-
ность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов
человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).
Молекулярная идентификация генов открывает широкие
возможности для анализа тканеспецифической регуляции их
экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от
транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного
анализа является генотипирование мутаций и исследование тех
нарушений в структуре, локализации или в ферментативной ак-
тивности соответствующих белков, которые возникают в резуль-
тате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти
проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.
Отметим только, что в настоящее время подобные исследования
стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний
человека, для которых идентифицированы геномные последова-
тельности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол-
норазмерные кДНК-последовательности.
Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
Международная программа "Геном человека".
Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации
о генетических картах хромосом человека, локализации и функ-
циях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят
исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в
Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством
профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований
является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между
последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содер-
жащих сводные данные о всех картированных генах человека и
связанных с ними наследственных болезнях под названием:
"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих
генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in
man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive,
and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные
хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обоб-
щенные в виде отдельных статей сведения о характере наследо-
вания, функциях и размерах генов; методах их картирования и
идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, по-
лиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявле-
ниях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а
также о природе основного дефекта, включая патогенез и пато-
физиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими
литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным ло-
кусам с различным типом наследования и по генам наследствен-
ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хро-
мосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названи-
ям генов или по наименованиям соответствующих генных болез-